Neuartige 3D-In-situ-Visualisierung der Larven des Robbenherzwurms (Acanthocheilonema spirocauda) in der Robbenlaus (Echinophthirius horridus) von X

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 14078 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Der Robbenherzwurm Acanthocheilonema spirocauda (Nematoda: Onchocercidae) parasitiert das Herz und die Lungenarterien verschiedener Phocid-Robben der nördlichen Hemisphäre. Über viele Jahrzehnte hinweg wurden mögliche Überträger dieses Parasiten diskutiert, und bis heute ist der Lebenszyklus nicht vollständig bekannt. Die Robbenlaus Echinophthirius horridus (Anoplura: Echinophthiriidae) ist ein obligatorischer, permanenter und hämatophager Ektoparasit von Phociden, von dem angenommen wurde, dass er als obligater Zwischenwirt für A. spirocauda fungiert. Wir untersuchten 11 erwachsene E. horridus-Exemplare, die von gestrandeten Seehunden (Phoca vitulina) während der Rehabilitation im Robbenzentrum Pieterburen gesammelt wurden, mittels Röntgen-MikroCT-Bildgebung, um die Infektionsstellen der Larven von A. spirocauda in situ darzustellen. In drei dieser Exemplare wurden fadenförmige Larven in Insektenorganen nachgewiesen. Detaillierte Aufnahmen der am stärksten infizierten Laus zeigten insgesamt 54 A. spirocauda-Larven, die sich entweder in Fettkörpern oder im Hämocoel befanden. Die histologische Analyse derselben Probe veranschaulichte Nematodenquerschnitte und bestätigte die Röntgen-MicroCT-Daten. Die aktuellen Daten deuten stark darauf hin, dass E. horridus ein natürlicher Zwischenwirt für A. spirocauda ist. Darüber hinaus demonstrieren wir das Potenzial der röntgenmikroCT-basierten Bildgebung als zerstörungsfreie Methode zur Analyse von Wirt-Parasit-Interaktionen, insbesondere im vernachlässigten Bereich der Parasitologie von Meeressäugern.

Acanthocheilonema spirocauda (Leidy, 1858) Anderson, 1992 ist ein angiotroper mariner parasitärer Fadenwurm aus der Familie der Onchocercidae (Überfamilie Filarioidea)1, der ein breites Spektrum an Phocid-Robbenarten auf der Nordhalbkugel parasitiert, darunter Seehunde (Phoca vitulina), Ringelrobben ( Pusa hispida) und die vom Aussterben bedrohten Mittelmeer-Mönchsrobben (Monachus monachus)2,3. In den Endwirten leben erwachsene A. spirocauda hauptsächlich im rechten Ventrikel und Vorhof des Herzens sowie in den Lungenarterien und erreichen eine Körperlänge von mehr als 20 cm1,2,3,4,5,6. Epidemiologische Studien zu A. spirocauda-Infektionen bei frei lebenden P. vitulina im Wattenmeer zeigten unterschiedliche Prävalenzen (32 %7, 25 %4, 6 %5 und 4 %6). A. spirocauda-Infektionen werden überwiegend bei unreifen Robben gemeldet4,5,6,8,9 und scheinen den Gesundheitszustand der Tiere nicht wesentlich zu beeinträchtigen5,6. Die geringe Prävalenz von A. spirocauda-Infektionen bei älteren Robben4,5 könnte jedoch auf eine hohe Sterblichkeit bei stark infizierten jungen Robben zurückzuführen sein1,10. A. spirocauda-assoziierte Läsionen wurden in parasitierten Herzen beschrieben, sogar mit tödlichen Folgen5,10. Beispielsweise berichteten Lehnert et al.5 über eine Perforation des rechten Vorhofs mit ausgeprägtem Perikarderguss als Todesursache bei einem schwer infizierten Seehund.

Über viele Jahrzehnte hinweg wurden Übertragungswege und mögliche natürliche Zwischenwirte von A. spirocauda diskutiert, der gesamte Lebenszyklus ist jedoch noch nicht vollständig bekannt (für eine Übersicht siehe Leidenberger et al.1). Erwachsene weibliche A. spirocauda sind lebendgebärend und geben Mikrofilarien in den Blutkreislauf der Endwirte ab1. Eine diaplazentare Übertragung von Mikrofilarien wurde vermutet, aber aufgrund der geringen Infektionsraten bei erwachsenen Robben scheint dieser Weg keine große Rolle zu spielen1. Übereinstimmend wurde die Hypothese aufgestellt, dass die hämatophage Meeresrobbenlaus, Echinophthirius horridus (von Olfers, 1816) Fahrenholz, 1919 (Anoplura: Echinophthiriidae) (Abb. 1), der natürliche obligate Zwischenwirt dieses Fadenwurms sein könnte1,11. Vertreter der Familie Echinophthiriidae sind obligatorische und permanente ektoparasitäre Insekten12 und im Gegensatz zu terrestrischen Anopluranen sind sie stark an die Meeresumgebung angepasst13. Während verschiedene Echinophthiriidenarten eine strenge Wirtsspezifität aufweisen, weist die Robbenlaus E. horridus ein recht breites Wirtsspektrum auf, indem sie acht verschiedene Phocid-Robbenarten befällt, darunter Seehunde und Ringelrobben12. Ähnlich wie A. spirocauda ist auch E. horridus auf die nördliche Hemisphäre beschränkt12 und kommt hauptsächlich bei unreifen Robben vor6. Aufgrund ihrer obligaten und permanenten hämatophagen Ernährungsgewohnheiten übertragen und verbreiten Echinophthiriiden-Arten wahrscheinlich vektorübertragene Bakterien wie Anaplasma phagocytophilum, Bartonella henselae, Mycoplasma sp., Rickettsia sp. und Salmonella enteritidis in frei lebenden Flossenfüßerpopulationen14,15 ,16,17.

Stereomikroskopische und rasterelektronenmikroskopische (REM) Bilder der Robbenlaus, Echinophthirius horridus. (a) Dorsale und (b) ventrale Ansicht der stark infizierten weiblichen Laus mit einem prallen graviden Bauchbereich. (c) Der umkehrbare Rüssel wurde für den hämatophagen Lebensstil entwickelt. (d) Modifizierte Setae als Sinnesorgane auf der Cuticula. Maßstabsbalken: (a, b) 500 µm, (c, d) 50 µm.

Filarioide Nematoden, die Menschen und Landsäugetiere befallen, haben alle einen obligaten heteroxenen Lebenszyklus, an dem hämatophage Ektoparasiten als Zwischenwirte beteiligt sind18. Innerhalb der Gattung Acanthocheilonema parasitieren die meisten Vertreter subkutanes Gewebe und Bauchhöhlen von Säugetierwirten, und es wurde über eine breite Palette kompetenter Arthropodenvektoren berichtet, darunter Zecken (z. B. Ornithodorus tartakovskyi für A. vitae bei Nagetieren19), Lausfliegen (z. B. Hippobosca longipennis für A. dracunculoides bei Hunden20) und sogar Kau- und Anopluran-Läuse (z. B. Heterodoxus spiniger und Linognathus setosus für A. reconditum bei Hunden21). Dennoch ist sehr wenig über Zwischenwirte von Filarioidparasiten bekannt, die in Meeressäugetieren zirkulieren1,17,22.

Da es in frühen Studien aus den sechziger und siebziger Jahren nicht gelang, A. spirocauda-Stadien in E. horridus nachzuweisen, wurden Culex pipiens-Mücken und simuliide Kriebelmücken als potenzielle Vektoren angenommen10,23. Im Jahr 1981 gelang es Geraci et al.24 erstmals, verschiedene Larvenstadien von A. spirocauda in präparierten E. horridus-Exemplaren nachzuweisen. Sie fanden A. spirocauda-Larven in 70 von 102 Läusen, die aus einer gesträngten P. vitulina stammten, die ebenfalls Mikrofilarämie aufwies. Die Autoren beschrieben vier Larvenstadien [Mikrofilarien, Larven im ersten Stadium (L1), Larven im zweiten Stadium (L2) und Larven im dritten Stadium (L3)], die sich in Größe und Morphologie unterschieden und im Fettkörper, dem Magen-Darm-Trakt, lokalisiert waren Tractus, das Hämocoel, die Krallen und der Kopf sezierter Läuseexemplare24. In den folgenden Jahren stellten Dailey und Fallace25 eine signifikante Korrelation zwischen natürlichen Robbenherzwurminfektionen und dem Befall mit Robbenläusen bei Seehunden dar, und Lehnert et al.6 fanden eine einzelne A. spirocauda-Larve während der Sektion von 35 erwachsenen Robbenläusen. Die jüngste molekulare Diagnose von A. spirocauda bei E. horridus-Läusen stützte stark die Hypothese der Vektorkapazität von E. horridus17,26. Dennoch stellt die Studie von Geraci et al.24 die detaillierteste Analyse verschiedener Larvenstadien und ihrer Entwicklung bei E. horridus-Läusen dar und stellt damit bis heute die überzeugendste Stütze dieser Hypothese dar.

Zum Nachweis von Protozoen- und Metazoen-Parasiten im Gewebe von Arthropoden können Ektoparasiten auf unterschiedliche Weise untersucht werden, einschließlich Dissektionen6,20,21,24, pathohistologischen Untersuchungen27 und der Verwendung molekularer Methoden17,26. In den letzten Jahren wurde die Röntgen-MikroCT-Bildgebungstechnik als nicht-invasive und zerstörungsfreie Methode eingesetzt, um neue dreidimensionale Einblicke in die Wirt-Parasit-Beziehungen zu gewinnen28,29,30,31. Bisher gibt es jedoch nur wenige Studien in der medizinischen und veterinärmedizinischen Parasitologie, die diese bildgebende Technik nutzen32. Daher wollten wir in dieser Studie dazu beitragen, die Rolle von E. horridus als Zwischenwirt von A. spirocauda mithilfe der 3D-Röntgen-MikroCT-Bildgebung zu untersuchen. Mit dieser zerstörungsfreien Technologie untersuchten wir erwachsene E. horridus-Exemplare von natürlich befallenen Seehunden während ihrer Rehabilitation im Robbenzentrum Pieterburen auf das Vorhandensein und die In-situ-Lokalisierung verschiedener Larvenstadien von A. spirocauda. Die dreidimensionale Visualisierung verschiedener Larvenstadien und deren gewebebezogene Zuordnung soll dazu beitragen, bestimmte Schritte im heteroxenen Lebenszyklus von A. spirocauda und die allgemeine Rolle von E. horridus als Zwischenwirt in marinen Ökosystemen zu klären.

Für die Röntgen-MikroCT-Bildgebung wurden insgesamt 11 erwachsene Echinophthirius horridus-Läuse aus einem Pool verschiedener konservierter Exemplare (n = 53) ausgewählt, die alle von verschiedenen, ursprünglich frei lebenden, gestrandeten Seehunden während ihrer Rehabilitationsphase stammten das Robbenzentrum Pieterburen, Niederlande. Daher war der tatsächliche Infektionsstatus konservierter E. horridus-Proben unbekannt. Darüber hinaus lagen zum Zeitpunkt des Versuchsbeginns keine Informationen zum Acanthocheilonema spirocauda-Infektionsstatus der Robben (oder zum Vorliegen einer Mikrofilarämie) vor. Allerdings konnten Hirzmann et al.17 inzwischen das Vorhandensein von A. spirocauda-DNA im gleichen Pool von E. horridus-Läusen nachweisen. Die individuelle Auswahl erwachsener weiblicher Proben für die 3D-Bildgebung basierte auf morphologischen Gesichtspunkten (praller Bauchbereich, typische zwei Gonopodenpaare und eine Körperlänge von mehr als 2,5 mm), um die Wahrscheinlichkeit des Screenings auf Läuse zu erhöhen, die ausgiebig Robbenblut gesaugt hatten .

In einem ersten Experiment wurden 11 weibliche E. horridus untersucht, um einen Überblick über die Morphologie der Arthropoden sowie die anatomischen Merkmale, Lage und Maße der Organe zu erhalten. Da es sich bei dieser Studie nach unserem besten Wissen um die erste Röntgen-MikroCT-Bildanalyse von Echinophthiriidenläusen handelt, wurden Messungen und morphologische Details verschiedener Organe verschiedener E. horridus-Proben verglichen. Unter Berücksichtigung bekannter Mikrohabitate von A. spirocauda-Larven innerhalb von E. horridus24 wurden insbesondere subkutikuläre Fettkörper und das Hämocoel von Läusen sorgfältig untersucht. Wir fanden Unregelmäßigkeiten in der Fettkörperdichte in drei von 11 E. horridus-Exemplaren (27 %). Durch 3D-Rekonstruktion wurden diese heterogenen Einschlüsse in Fettkörpern als fadenförmige, oft wurstförmige Strukturen rekonstruiert, die sich deutlich vom umgebenden Insektengewebe unterscheiden ließen. Basierend auf dem molekulargenetischen Nachweis von A. spirocauda im selben Pool beprobter Robbenläuse17 als Hauptdiagnose- und Identifizierungskriterium wurden diese Strukturen als A. spirocauda-Larven interpretiert.

In der zweiten Phase dieser Studie wurde ein weibliches E. horridus-Individuum, das auffällige Larvenstrukturen in Insektenorganen aufwies, einer hochauflösenden Bildgebung unterzogen (Abb. 2, 3; Zusatzvideo 1). Insgesamt wurden 54 A. spirocauda-Larven mit einer Gesamtkörperlänge von 76 bis 1527 µm nachgewiesen, von denen 45 Larven (83 %) in Fettkörpern eingeschlossen und eingekapselt waren und eine Länge zwischen 76 und 779 µm hatten. Nur zwei im Fettkörper lokalisierte Larven erreichten eine Körperlänge von über 600 µm (Abb. 3). Im Allgemeinen wirkten die in Fettkörpern vorkommenden A. spirocauda-Larven stark verdreht und zeigten eine typische Wurstform (Abb. 4). Neun Larven (17 %) befanden sich frei im Hämocoel und wiesen Körperlängen von 615–1527 µm auf (Abb. 3). Insgesamt wiesen die längsten Larvenstadien eine Körperlänge von > 1000 µm auf (1122–1527 µm, n = 7) und befanden sich ausschließlich im Hämocoel der Robbenlaus.

Röntgen-MicroCT-Bildanalyse und 3D-Rekonstruktion von Echinophthirius horridus mit verschiedenen Acanthocheilonema spirocauda-Larven (farbige, schnur- bis wurstförmige Strukturen) in verschiedenen Körperschichten. In-situ-Visualisierung. (a) Ventrale Ansicht. (b) Seitenansicht (c). Kaudale Ansicht. Maßstabsbalken: 500 µm. Abkürzungen: a = Verdauungstrakt, cd = kaudal, cr = kranial, lfb = im Fettkörper verdrehte Larven, lh = im Hämocoel lokalisierte Larven, m = Muskulatur, r = Fortpflanzungstrakt (Nissen/Eier), sha = modifizierte Borsten zu Haaren, tpl = drittes Beinpaar.

3D-Rekonstruktion von Echinophthirius horridus basierend auf Röntgen-Mikro-CT, die Acanthocheilonema spirocauda-Larven nach Körperlänge geordnet zeigt. (a) Ventrale Ansicht. (b) Seitenansicht. (c) Kaudale Ansicht. (d) Übersicht über die Larvenlokalisation im Verhältnis zur Körperlänge. Maßstabsbalken: 500 µm.

3D-Rekonstruktion des Fettkörperelements von Echinophthirius horridus. (a) Gelb markierter Fettkörper, (b) der im Inneren eine pralle, wurstförmige Acanthocheilonema spirocauda-Larve (möglicherweise im L1-Stadium) freigibt. (c) Isolierter Fettkörper, der die Larve von A. spirocauda enthält. Maßstabsbalken: 100 µm. Abkürzungen: cu = Kutikula, fb = Fettkörper, sha = zu Haaren modifizierte Setae.

Um zu bestätigen, dass es sich bei den durch Röntgen-MikroCT-Bildgebung beobachteten fadenförmigen Strukturen tatsächlich um Larven von A. spirocauda handelte, wurde das stark infizierte E. horridus-Individuum einer histologischen Analyse unterzogen. Unter Verwendung von Halbdünnschnitten zeigten auffällige Bereiche in E. horridus-Fettkörpern und Hämocoel tatsächlich mehrere kapselartige Strukturen, die Nematodenquerschnitte enthielten. Es konnten Nematodenkutikula und innere Larvenorgane identifiziert werden, einschließlich Verdauungstrakt, Muskulatur und Seitensehnen (Abb. 5, 6), wodurch ein endgültiger Beweis für das Vorhandensein von A. spirocauda-Larven in E. horridus geliefert und Röntgen-MikroCT-Analysen bestätigt wurden.

Röntgen-MikroCT-Bilder mit markierten Larvenstrukturen und histologischen Querschnitten. Maßstabsbalken: 100 µm. Abkürzungen: cu = Lauskutikula, fb = Fettkörper, ha = Hämocoel, lfb = im Fettkörper verdrehte Larven, lh = im Hämocoel lokalisierte Larven, m = Muskulatur, sha = zu Haaren modifizierte Setae.

Histologische Querschnitte zeigen mehrere in Fettkörpern eingekapselte Acanthocheilonema spirocauda-Larven. Maßstabsbalken: (a, b) 50 µm, (c) 20 µm. Abkürzungen: a = Nematoden-Verdauungstrakt, ca = Kapsel, cu = Nematoden-Kutikula, fb = Fettkörper, lc = Nematoden-Seitenstränge, lfb = im Fettkörper verdrehte Larven, m = Nematoden-Muskulatur.

Bisher deuten nur wenige Studien auf eine Rolle von Echinophthirius horridus als obligater Zwischenwirt im heteroxenen Lebenszyklus von Acanthocheilonema spirocauda hin. Dies basierte auf dem morphologischen Nachweis verschiedener Larvennematodenstadien (d. h. Mikrofilarien, L1, L2, L3) während der Sektion von E. horridus-Proben6,24, einer signifikanten statistischen Korrelation zwischen dem Befall mit Robbenläusen und Infektionen mit Herzwürmern bei Seehunden25 und eine molekulare Xeno-Überwachung von A. spirocauda in E. horridus17,26. Zum ersten Mal verwendeten wir hier Röntgen-MikroCT-Bildgebung, um Stadien von A. spirocauda-Larven in ihren In-situ-Mikrohabitaten innerhalb der Robbenlaus dreidimensional sichtbar zu machen. Dabei wurden Larvenstadien unterschiedlicher Länge und Lokalisation nachgewiesen, was zeigt, dass sich dieser Nematodenparasit in der Robbenlaus zu bis zu 1527 µm langen Stadien entwickeln kann. Unsere Ergebnisse unterstützen die Rolle von E. horridus als obligater Zwischenwirt von A. spirocauda im Meeresökosystem und spielen somit eine wesentliche Rolle bei der Übertragung von Krankheitserregern und der Aufrechterhaltung der Acanthocheilonemose in freilebenden Robbenpopulationen.

Mithilfe der nicht-invasiven Röntgen-MikroCT-Bildgebung wurden verschiedene wurmartige Strukturen in verschiedenen Organen von E. horridus dargestellt. Die histologische Untersuchung derselben Probe bestätigte die auf Röntgenmikro-CT basierende Diagnose und bewies, dass es sich bei diesen fadenförmigen Strukturen im Fettkörper und im Hämocoel tatsächlich um Nematodenlarven handelte. Dabei erfolgte die Identifizierung der erkannten Nematoden als A. spirocauda auf der Grundlage folgender Erkenntnisse: (i) In dieser Studie analysierte E. horridus-Proben wurden im Rahmen einer Überwachungsstudie zu vektorübertragenen Krankheitserregern bei Robbenläusen und dem Vorhandensein von A. horridus entnommen . Spirocauda-DNA im gleichen Pool von E. horridus-Proben wurde bestätigt17. Neben der Entwicklung einer spezifischen verschachtelten PCR für den Nachweis von A. spirocauda untersuchten Hirzmann et al.17 verschiedene E. horridus-Pools mit Pan-Filarien-Primern auf ein breites Spektrum an Filarien-Nematoden33 und es konnten keine anderen Filarioid-Arten oder Mischinfektionen vorliegen entdeckt17 Dabei wurde dieser molekulargenetische Beweis als Hauptdiagnosekriterium für die Identifizierung von A. spirocauda in der vorliegenden Studie verwendet. (ii) A. spirocauda ist ein häufiger Endoparasit von Seehunden (Phoca vitulina) und die einzige beschriebene angiotrope Filarioid-Nematodenart, die Seehunde im Wattenmeer infiziert4,5,6,7. (iii) Dirofilaria immitis, ein weiterer filarioider Fadenwurm18, wurde schon früher in P. vitulina beschrieben34, wurde jedoch bei diesem Wirt im Wattenmeer nie nachgewiesen. Darüber hinaus ist bekannt, dass D. immitis durch Mücken übertragen wird35 und wurde noch nie bei Echinophthiriidenläusen nachgewiesen17.

Das Potenzial der Röntgen-Mikro-CT als Methode zur nicht-invasiven und zerstörungsfreien Visualisierung und Analyse von Wirt-Parasit-Interaktionen wurde bereits durch andere Studien28,29,30,31 gezeigt. Wir beleuchten diese Vorteile nach unserem besten Wissen zum ersten Mal in dieser Studie am Beispiel einer Echinophthiriidenlaus. Dadurch zeigen unsere Daten deutlich, dass die nicht-invasive 3D-Bildgebung Einblicke in detaillierte anatomische Strukturen eines Insekten-Ektoparasiten und seiner potenziellen Pathogenfauna ermöglicht und gleichzeitig die Insektenmorphologie vollständig bewahrt. Eine eindeutige Analyse der (inneren) Larvenmorphologie, der Stadieneinteilung oder gar der Artenidentifizierung ist mit dieser Methode jedoch nicht möglich. Durch die Nutzung des nicht-invasiven und zerstörungsfreien Aspekts dieser Bildgebungstechnologie könnten diese Nachteile und Einschränkungen durch die Kombination von Röntgen-MikroCT mit anderen diagnostischen Methoden wie der Präparation von Läusen und der genauen morphologischen Identifizierung und Charakterisierung von Larven mittels Lichtmikroskopie ausgeglichen werden. Bisher wurden Röntgen-MikroCT-Analysen in der medizinischen und veterinärmedizinischen Parasitologie kaum eingesetzt32. Darüber hinaus stellt die Vektorrolle der meisten Echinophthiriidenarten weltweit ein vernachlässigtes Forschungsthema im Bereich der Parasitologie von Meeressäugern dar17, obwohl ihr obligatorischer, permanenter und hämatophager Modus vivendi hervorragend für die Übertragung von Krankheitserregern geeignet ist. Wir demonstrieren das Potenzial der nicht-invasiven 3D-Röntgen-MicroCT-Bildgebung für das Pathogen-Screening bei Ektoparasiten, das auf ein breites Spektrum von Untersuchungen in der veterinärmedizinischen und medizinischen Entomologie angewendet werden kann.

Geraci et al.24 lieferten den stärksten Beweis dafür, dass E. horridus ein Zwischenwirt für A. spirocauda ist. Sie entdeckten A. spirocauda-Larven in 70 von 102 präparierten Robbenläusen und klassifizierten diese Larvenstadien anhand der Körperlänge und anderer morphologischer Merkmale als Mikrofilarien, L1, L2 und L324. Überlappende Längen bei Referenzmessungen und sehr variable Larvenlängen in der aktuellen Studie ermöglichten in dieser Analyse keine Identifizierung des Entwicklungsstadiums. Darüber hinaus konnten bestimmte morphologische Parameter, die zur Identifizierung des Larvenstadiums verwendet werden, wie ein Kopfknauf in L1, bestimmte innere Strukturen wie die Speiseröhre in L2 oder papillenartige Strukturen am hinteren Ende von L324, mit der verwendeten Bildgebungstechnik nicht erkannt werden, wodurch das Stadium beeinträchtigt wird Identifikation. Interessanterweise waren in der aktuellen Studie 16 Larven (mit einer Länge von 76–195 µm) kürzer als 197 µm, ein gemessener Wert, der von Geraci et al.24 als minimale Körperlänge von A. spirocauda-L1 definiert wurde. L1-Stadien wurden auch als „Wurst“-Stadium24 definiert, ein Begriff, der auch von anderen filarioiden Nematoden bekannt ist, z. B. D. immitis35. Allerdings könnte die Larvenlänge auch durch Fixierung oder Färbung beeinflusst worden sein. Beispielsweise hielten Geraci et al.24 nach der Dissektion von E. horridus die Larvenstadien in physiologischer Kochsalzlösung, während E. horridus-Proben in dieser Studie in 80 %igem Ethanol fixiert und mit Lugols Lösung angefärbt wurden. Es ist bekannt, dass beide Verbindungen eine Gewebeschrumpfung verursachen. Da unsere Daten nicht hinsichtlich der Schrumpfung korrigiert wurden, sollten die dargestellten Daten zur Larvenlänge mit Vorsicht interpretiert werden. Basierend auf unseren Daten stellt die Röntgen-Mikro-CT-Bildgebung jedoch ein geeignetes Werkzeug zur Erkennung kleiner Larven dar, die bei stereomikroskopisch gesteuerten Präparationen von Läusen möglicherweise übersehen oder beschädigt werden könnten. Darüber hinaus haben Geraci et al.24 2 % formalinfixierte Mikrofilarienstadien gemessen, die aus einem mikrofilarämischen Seehund stammen24. Die Stadien wurden ausschließlich im Magen-Darm-Trakt der untersuchten Proben gefunden24. Basierend auf diesen Beobachtungen ist es möglich, dass es sich bei den in der aktuellen Studie gefundenen Larvenstadien, die sich in Fettkörpern befinden, um L1-Stadien handelt.

Die aktuellen Daten belegen eine hohe A. spirocauda-Larvenbelastung (54 Larven in einer einzigen weiblichen Laus) und unterstreichen die enorme Rolle von Echinophthiriidenläusen für die wirksame Übertragung von Krankheitserregern. Im Vergleich zu den Daten von Geraci et al.24 handelt es sich bei der in der vorliegenden Studie analysierten Probe um eine stark infizierte Robbenlaus. In Bezug auf die mittlere Parasitenbelastung berichteten Geraci et al.24, dass 87 % der infizierten E. horridus 4,6 L1-Stadien aufwiesen, 54 % 3,0 L3-Stadien und 26 % 1,4 L2-Stadien aufwiesen. Darüber hinaus beschrieben die Autoren den Fettkörper der Robbenlaus als Hauptstandort der Larven von A. spirocauda, Larven wurden jedoch auch im Magen-Darm-Trakt, im Hämocoel, in den Klauen und im Kopf von E. horridus-Proben gefunden24. In der vorliegenden Studie fanden wir Larvenstrukturen ausschließlich in Fettkörpern und im Hämocoel von E. horridus. Sechs Larven wiesen eine Körperlänge von > 1170 µm auf und können, wenn man den Klassifizierungskriterien von Geraci et al.24 folgt, als L3 klassifiziert werden. Interessanterweise wurden diese großen und gewundenen Larven ausschließlich im Hämocoel gefunden.

Unter Einbeziehung früherer Berichte über A. spirocauda bei Robbenläusen6,17,24,26 und Daten anderer Filarioidparasiten35,36,37,38 tragen die Ergebnisse der aktuellen Studie dazu bei, den Lebenszyklus dieses Nematoden in seinem vorgeschlagenen Zwischenwirt weiter zu entschlüsseln . Nach der Aufnahme von A. spirocauda durch E. horridus über eine Blutmahlzeit müssen Mikrofilarien zur weiteren Entwicklung zwangsläufig den Verdauungstrakt verlassen, wie dies auch für andere filarioide Nematoden bekannt ist, z. B. D. immitis, D. repens oder lymphatische Filarienarten35 ,36,37. Andernfalls werden nicht wandernde Stadien vom Insektenwirt ausgeschieden. Beim Eindringen in die Mitteldarmmembranen könnten Mikroläsionen und Gewebeschäden auftreten, wie es bei Membranläsionen beim Vektor Aedes aegypti berichtet wurde, die durch Mikrofilarien der lymphatischen Filarien Brugia malayi verursacht wurden39. Für Dirofilaria spp. stellen die Malpighian-Tubuli des Mückenvektors die bevorzugte Migrationsstelle der L1- und L2-Stadien dar35, während die Brustmuskulatur als bevorzugtes Mikrohabitat für lymphatische Filarienparasiten nach der Migration aus dem Mitteldarm gemeldet wurde37,38. Fettkörper von E. horridus scheinen ein bevorzugtes Mikrohabitat für die Larvenstadien von A. spirocauda zu sein, insbesondere für frühe, wie von Geraci et al.24 berichtet wurde. Dieser Effekt wurde auch in der aktuellen Studie gezeigt, wobei sich herausstellte, dass die Mehrheit der Larven (83 %) in Fettkörpern lokalisiert war, während nur zwei von ihnen eine Körperlänge über 600 µm erreichten. Ähnlich wie bei anderen Filarioiden wurde gezeigt, dass A. spirocauda-Stadien in ihrem potenziellen Vektor ein enormes Längenwachstum durchführen. Geraci et al.24 berichteten über eine bis zu zehnfache Länge infektiöser L3-Stadien im Vergleich zu aufgenommenen Mikrofilarien/L1-Stadien. Unter Berücksichtigung der in der aktuellen Studie entdeckten sehr kurzen Stadien erreichte die längste Larve in der aktuellen Studie (1527 µm) die 20-fache Länge des kleinsten Stadiums im Fettkörper (76 µm). Für die Übertragung auf Robben während der E. horridus-Hämatophagie müssen die Larven jedoch weiter in den Rüssel der Laus wandern, wie es bei anderen Vektoren bekannt ist35. Wie für lymphatische Filarientaxa38 berichtet wurde, wurden die L3-Stadien von A. spirocauda als sehr aktiv mit kräftigen Bewegungen beschrieben24, was auf eine effektive Migrationsmobilität aus dem Bauchbereich im Rüssel der Laus für die Übertragung zum versiegelten Endwirt hinweist.

In der Vergangenheit wurde über geringe Prävalenzen von E. horridus-Befall (4 %5 und 3 %6) und A. spirocauda-Infektion (6 %5 und 4 %6) bei gestrandeten Seehunden im deutschen Wattenmeer berichtet. Allerdings berichteten Lehnert et al.6 über einen deutlichen Anstieg der Prävalenz beider Erreger bei gestrandeten Seehunden im letzten Jahr der Studie (2013), der eine weitere Überwachung erfordert. Da die meisten Studien, die über niedrige E. horridus-Prävalenzen5,6 oder gar keine Ektoparasitenbefunde4,7,8 berichten, auf Autopsien gestrandeter Seehunde basieren, sollte berücksichtigt werden, dass Läuse ihren Wirt nach dem Tod verlassen könnten40. Zukünftige Prävalenzstudien, die auf Untersuchungen frei lebender oder gestrandeter Robben während Rehabilitationsphasen in Wildtierauffangstationen basieren, könnten dabei helfen, das in vivo-Vorkommen dieser Ektoparasitose besser zu verstehen.

Unter den Echinophthiriidenläusen wurden bisher nur wenige Arten auf ihre Vektorfunktion untersucht14,15,16,17. Bisher war E. horridus die einzige Echinophthiriidenart, bei der vermutet wurde, dass sie als Zwischenwirt für eine metazoische Parasitenart fungiert, nämlich den Filarioidennematoden A. spirocauda1,24. Dennoch könnte auch eine andere Echinophthiriidenart am Lebenszyklus von A. spirocauda beteiligt sein, beispielsweise Lepidophthirus piriformis, der speziell Mittelmeer-Mönchsrobben in Europa befällt. Diese Robbenart wurde kürzlich als neuer Wirt für A. spirocauda registriert, da zwei erwachsene Nematoden im rechten Ventrikel eines gestrandeten Tieres gefunden wurden3. Allerdings wurden in diesem Fallbericht keine Ektoparasiten nachgewiesen3. Ein weiterer eng verwandter mariner Fadenwurm, nämlich A. odendhali, parasitiert in den intermuskulären Faszien und Körperhöhlen von Flossenfüßern wie dem Kalifornischen Seelöwen (Zalophus californianus), dem Steller-Seelöwen (Eumetopias jubatus) und dem Nördlichen Seebären (Callorhinus ursinus). ). Es gilt hauptsächlich als nicht pathogen, umfasst aber auch hämatophage Wirbellose als Zwischenwirte22,41. Der Lebenszyklus von A. odendhali ist jedoch völlig unbekannt, weshalb blutsaugende Ektoparasiten als obligate Zwischenwirte vermutet wurden22,41. Darüber hinaus sind Kalifornische Seelöwen und Steller-Seelöwen Endwirte der Echinophthiriidenlaus Antarctophthirus microchir12, deren mögliche Rolle bei der Übertragung von Krankheitserregern bisher noch nie untersucht wurde. Interessanterweise erwiesen sich auch freilaufende und in Gefangenschaft lebende Kalifornische Seelöwen sowie andere Otariiden und Phocidien als anfällig für Infektionen mit D. immitis34,41. Basierend auf dem breiten Spektrum an Übertragungshypothesen sind künftige Studien zur Vektorrolle anderer Echinophthiriidenarten dringend erforderlich, um das aktuelle Wissen über durch Arthropoden übertragene Krankheiten bei Flossenfüßern in der hochkomplexen Meeresumwelt zu erweitern.

Proben von Echinophthirius horridus wurden Mitte 2012 im Rahmen einer früheren groß angelegten Überwachungsstudie zu vektorübertragenen Krankheitserregern im Robbenzentrum Pieterburen, Niederlande, entnommen17. Die Probenahme erfolgte ausschließlich im Rahmen routinemäßiger klinischer Diagnoseverfahren an gestrandeten Seehunden, die zugelassen wurden eine Rehabilitationsphase. Mithilfe von Läusekämmen und einer Pinzette wurden E. horridus-Proben aus dem Robbenfell entfernt und anschließend sofort für weitere Untersuchungen in 80 % EtOH gelagert. Aufnahme- und Rehabilitationsverfahren für verschiedene Robbenarten im Robbenzentrum Pieterburen wurden von der niederländischen Regierung genehmigt (Genehmigungs-ID zum Zeitpunkt der Probenentnahme: FF/75/2012/015).

Die Probenvorbereitung umfasste die Jodfärbung und das Anbringen von Läusen und folgte etablierten Protokollen42 mit geringfügigen Änderungen. Läuse wurden in 80 % EtOH fixiert. Vor dem Färben wurden die Proben zweimal eine Stunde lang in destilliertem Wasser gewaschen, um Ethanolreste zu entfernen. Danach wurden die Läuse 24 Stunden lang in 1% Lugols I2KI-Lösung (Gatt-Koller, Absam, Österreich) gelegt. Abschließend wurden die Proben zweimal eine Stunde lang in destilliertem Wasser gewaschen.

Zur Montage wurden 200 μl Pipettenspitzen (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Deutschland) an der Spitze heißversiegelt und mit niedrig schmelzender Agarose (Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland) gefüllt. Agarose wurde erhitzt, bis die Viskosität das Füllen der Pipettenspitze ermöglichte. Anschließend wurden gefärbte Läuse mit Dissektionsnadeln in die Pipettenspitze montiert (3–4 Proben pro Spitze). Enge Abstände zwischen den Proben waren wichtig, um vier Proben in einem Sichtfeld abzubilden, während Berührungspunkte vermieden wurden.

Alle Mikro-CT-Scans wurden mit einem XRadia MicroXCT-400 (Carl Zeiss X-ray Microscopy, Pleasanton, CA, USA) aufgenommen. In einem ersten Schritt wurden Übersichtsscans mit der 4X-Detektorbaugruppe (kein Detektor-Binning) mit einer Röntgenquellenspannung von 60 kVp und einem Strom von 133 µA aufgenommen. Das emittierte Röntgenspektrum wurde mit dem Zeiss LE2-Filter gefiltert. Projektionsbilder wurden über eine 360°-Rotation mit einer Belichtungszeit von 30 s und einem Winkelinkrement von 0,225° zwischen den Projektionen aufgenommen. Das Sichtfeld der Übersichtsscans betrug etwa 5 × 5 mm und deckte alle Lausproben in der Pipettenspitze ab. Die isotrope Voxelauflösung in rekonstruierten Volumina von Übersichtsscans variierte zwischen 2,24 µm und 2,69 µm. Basierend auf der Analyse von Übersichtsscans wurde ein hochauflösender Scan vom Abdomen einer Probe mit der 10X-Detektorbaugruppe (kein Detektor-Binning) mit einer Röntgenquellenspannung von 40 kVp und einem Strom von 200 µA (kein Röntgen) aufgenommen Filter). Projektionsbilder wurden über eine 360°-Rotation mit einer Belichtungszeit von 45 s und einem Winkelinkrement von 0,225° zwischen den Projektionen aufgenommen. Die isotrope Voxelauflösung im rekonstruierten Volumen des hochauflösenden Scans betrug 1,09 µm. Alle Bildvolumina wurden im DICOM-Format gespeichert.

Übersichtsscans wurden mithilfe von FIJI imageJ43 auf das Vorhandensein von Nematodenlarven untersucht. Der hochauflösende Scan eines Lausabdomens wurde in das 3D-Softwarepaket Amira 2019.4 (FEI SAS, Teil von Thermo Fisher Scientific) importiert. Zur Rauschreduzierung wurde das Bildvolumen mit zwei Schritten der bilateralen 3D-Filterung gefiltert (Schritt 1: Kernel = 3 × 3 × 3, Ähnlichkeit = 20.000; Schritt 2: Kernel = 3 × 3 × 3, Ähnlichkeit = 40.000), gefolgt von einem Schritt der 3D-Gauß-Filterung (Kernelgrößenfaktor = 2, Standardabweichung = 1). Nematodenlarven wurden manuell mit dem Segmentierungseditor segmentiert. Basierend auf den Segmentierungsmasken wurde das Tool „Distance-Ordered Thinner“ (Len of Ends = 8) gefolgt vom Tool „Trace Lines“ zur Skelettierung verwendet, um für jede Larve ein räumliches Diagramm zu extrahieren. Räumliche Diagramme wurden mit dem Tool „Liniensatz glätten“ geglättet (Glättung = 0,8, Einhaltung der Originaldaten = 0,05, Anzahl der Iterationen = 100). Schließlich haben wir das Tool „Spatial Graph Statistics“ verwendet, um die Länge von räumlichen Diagrammen zu messen. Zur Visualisierung verwendeten wir beide aus den Segmentierungsmasken generierten Oberflächen zusammen mit der Volumendarstellung des Lausabdomens sowie eine Visualisierung räumlicher Diagramme mit farbcodierter Länge.

Für histologische Analysen wurde die Probe etwa im Thoraxbereich in zwei Stücke geschnitten, um eine ordnungsgemäße Harzinfiltration sicherzustellen. Die erhaltenen Stücke wurden anschließend in einer angesäuerten Dimethoxypropanlösung dehydriert, gefolgt von mehreren Spülungen in reinem Aceton, bevor mit der Infiltration in Agar-Harz mit niedriger Viskosität (Agar, Stansted, Essex, UK) begonnen wurde. Nach dem Einbetten und Polymerisieren des Harzes wurden Streifen von Serienschnitten mit einem Diatome HistoJumbo-Diamantmesser (Diatome, Schweiz) durchgeführt. Die Schnitte wurden mit Toluidinblau gefärbt, versiegelt und anschließend mit einem Nikon NiU-Verbundmikroskop, das mit einer Nikon DsRi2-Mikroskopkamera (Nikon, Tokio, Japan) ausgestattet war, fotografiert und analysiert. Serienschnitte wurden mit FIJI43 in Graustufen umgewandelt und anschließend in die 3D-Visualisierungssoftware Amira (Thermo Fisher) importiert. Die Bilder wurden mit dem AlignSlices-Modul von Amira ausgerichtet. Anschließend wurden virtuelle Schnitte des CT-Stapels der parasitierten und rekonstruierten Probe unter Verwendung der histologischen Schnitte als Referenz platziert, um die CT-Informationen mit den histologischen Details zu vergleichen.

Die niederländische Regierung hat das Aufnahme- und Rehabilitationsverfahren für verschiedene Robbenarten im Robbenzentrum Pieterburen genehmigt (Genehmigungsausweis zum Zeitpunkt der Probenentnahme: FF/75/2012/015).

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Wir bedanken uns für die Unterstützung des Sealcentre Pieterburen bei der Probenentnahme. Darüber hinaus danken wir Annika Seipp (Institut für Anatomie und Zellbiologie, Justus-Liebig-Universität Gießen) für die Unterstützung bei der Rasterelektronenmikroskopie. Diese Forschung wurde mit Ressourcen der VetCore Facility (VetImaging) der Veterinärmedizinischen Universität Wien unterstützt. Diese Studie ist Madita gewidmet, einem unbeschwerten und naturliebenden jungen Mädchen, das sich für Meerestiere begeistert und eine wahre Inspiration für ihren Vater ist.

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL.

Institut für Parasitologie, Biomedizinisches Forschungszentrum Seltersberg, Justus-Liebig-Universität Gießen, Schubertstr. 81, 35392, Gießen, Deutschland

David Ebmer, Anja Taubert & Carlos Hermosilla

VetCore Facility for Research, Imaging Unit, Veterinärmedizinische Universität Wien, Veterinaerplatz 1, 1210, Wien, Österreich

Stephan Handschuh & Martin Glösmann

Abteilung für Evolutionsbiologie, Universität Wien, Djerassiplatz 1, 1030, Wien, Österreich

Thomas Schwaha

Sealcentre Pieterburen, Hoofdstraat 94a, 9968 AG, Pieterburen, Niederlande

Ana Rubio-Garcia

Institut für Anatomie und Zellbiologie, Justus-Liebig-Universität Gießen, Aulweg 123, 35385, Gießen, Deutschland

Ulrich Gärtner

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CH und DE haben die Studie entworfen und konzipiert. DE bereitete Proben vor, analysierte Daten, verfasste das Manuskript und bereitete Zahlen vor. SH führte Röntgen-MikroCT-Analysen durch und analysierte Datensätze. TS führte histologische Analysen durch. AR-G. durchgeführter und überwachter Probenahmeprozess. UG führte Rasterelektronenmikroskopie durch. MG und AT überprüften das Manuskript kritisch. Alle Autoren haben die endgültige Fassung des Manuskripts vor der Einreichung gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit David Ebmer.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Zusatzvideo 1.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Ebmer, D., Handschuh, S., Schwaha, T. et al. Neuartige 3D-In-situ-Visualisierung der Larven des Robbenherzwurms (Acanthocheilonema spirocauda) in der Robbenlaus (Echinophthirius horridus) mittels Röntgen-Mikro-CT. Sci Rep 12, 14078 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-18418-y

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Eingegangen: 07. Juni 2022

Angenommen: 10. August 2022

Veröffentlicht: 18. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-18418-y

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